تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی به یک فنوتیپ قلبی در قلب موش بالغ

تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی به یک فنوتیپ قلبی در قلب موش بالغ

قیمت:160000ریال

موضوع :

تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی به یک فنوتیپ قلبی در قلب موش بالغ

فرمت : ورد

عضله ی قلب بزرگسالان برخلاف عضله ی اسکلتی تواناییِ ترمیم پس از آسیب ایسکمی را ندارد و مرگ کاردیومایوسیت ها ( قلب ) منجر به ناتوانی قلب می شود. این قضیه باعث ایجاد توجه در شناسایی انواع سلول هایی می شود که قادر به جایگزینی میوکاردِ آسیب دیده با سلول های سالم و در نتیجه افزایش عملکرد قلبی می شود. در طول دهه گذشته تکنیک های پیوند سلولی قلب دستاوردهایی را بوجود آورده و تنوع موجود در انواع سلول ها به عنوان کاندید های مفید مطرح و ارائه شدند. توجه ویژه ای در رابطه با استفاده از سلول های ماهواره ای ماهیچه های اسکلتی و مایوبلاست ها بوجود آمد زیرا این سلول توانایی و قابلیت پیوند اتولوگ دارند. قبلا نشان دادیم که بقا و تمایز برای یک ماهیچه کند انقباض با فنوتیپ مایوبلاست های C₂C₁₂ می باشد که بطور سرخ رگی و شریانی به قلب موش آزاد می شوند. کار بعدی نشان داد که علاوه بر بقای نیوبلاست در نیوکاردیومِ آسیب دیده ، اثرات مثبتی نیز روی بازسازی و عملکرد بطن چپ وجود دارد. اولین کاردیو نیوپلاستیِ سلولی انسان با استفاده از نیوبلاست های اتولوگ همراه با نتایجی دلگرم کننده اخیراً گزارش شد.

یک داوطلب ایده آل برای کاردیومیوپلاست سلولی به احتمال زیاد سلولیست که می تواند تمایز قلبی را به طور کامل تحمل کند. چنین جمعیت سلولی ممکن است در مغز استخوان بزرگسالان یافت شود. در حال حاضر پذیرفته شده که اجتماع سلول های جدا شده از مغز استخوان و توسعه یافته در شرایط آزمایشگاهی، منبع بالقوه ای از سلول های بنیادی مزانشیمیِ تمایز نیافته را نشان می دهند که می تواند منجر به افزایش انواع سلول بافتیِ همبند شود. چنین سلول های مزانشیمیِ انسانی، ابتدا جدا شده و توانایی بالقوه ای برای تمایز چندگانه توسط Haynesworth و همکارانش نشان داده شد. اخیرا سلول های مزانشیمیِ انسانی را جدا کردیم و آن ها را کشت داده و توانایی چندگانه ی آن ها را با روش های آزمایشگاهی نشان دادیم.

شواهد داخل بدن از این نظریه که : سلول های بنیادی مزانشیمی قادر به تحمل تمایز قلبی می باشد، حمایت می کند. برای مثال، اجتماع سلول های بنیادی مزانشیمی از مغزِ استخوان موش جدا شده و به عضله ی چهار سر موش تزریق می شود که نشان می دهد سلول ها می توانند به طور موضعی در دیستروفین سارکوپلاسمای فیبر ماهیچه مشارکت کنند. هنگامیکه سلول های مغز استخوان از یک موش طبیعی نر به صورت داخل وریدی به سیاهرگِ دم موش تزریق می شود و روی mdx موش ماده تاثیر می گذارد. میولوله ها در دریافت کنندگان حاوی هسته ی y-مثبت بودند. سلول های بنیادی مزانشیمی موش بعد از تزریق به فنوتیپ میوژنی تبدیل می شوند و به ماهیچه ی اسکلتی آسیب دیده ی کاردیوتوکسین برمی گردند. همچنین بعد از حرارت دادن با عامل دِمتیلاسیونِ DNA،5-آزاسیتیدین، سلول های خطیِ شبیه به سلول مزانشیمی موش به منظور بیان نشانگرهای تمایز قلبی نشان داده شد و دپلاریزاسیون غشای خود به خودی را در شرایط آزمایشگاهی ارائه دادند. به تازگی Bittner و همکارانش نشان دادند که سلول های مشتق شده از مغز استخوان می توانند به هر دو ماهیچه ی اسکلتی و قلبی در موش mdx نیرو بخشیده و این ماهیچه های خط دار، بازسازی و تعمیر مستمر را تحمل می کنند.

در نتایج گزارش شده در این جا سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی به قلب موش تزریق می شوند تا دیده شود آیا این سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی قادر به تحملِ تفکیک یا تمایزِ وابسته به محیط هستند یا نه. سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی به بتاگالاکتوسیداز چسبیده و به بطنِ چپِ موشی که نقص ایمنی دارد تزریق شدند. حیوانات در چندین نقطه ی زمانمی کشته شدند و قلب شان برای تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی انسانیِ پیوند داده شده، مورد آنالیز قرار گرفتند.

روش ها

جداسازی سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی (hMSCs)

hMSCs ها همانطور که قبلا توضیح داده شد جدا شدند. به طور خلاصه بعد از امضای رضایت نامه ی مغزِ استخوانِ خارج شده از تاجِ خاصره ی پشتیِ داوطلبانِ سالم برداشته شد و به داخل یک سرنگ حاوی 6000 واحد هپارین ریخته می شود. نمونه ی مغز با Dulbecco PBS شستشو داده شده و سلول ها پس از سانتریفیوژ در 900 گرم، دوباره بدست آمده و ترمیم می شوند. سلول های هسته شکل، شمارش شده و 1 × 10⁸ سلول های هسته ای بر روی 25 میلی لیتر از محلول Percoll در لوله ی مخروطیِ 50 میلی لیتری، بارگذاری می شوند. سلول های هسته ای از لایه ی فوقانی در دمای 20 درجه سانتی گراد و سطح میانی جمع آوری شده، با حجمِ 2 محلولِ Dulbecco PBS رقیق شده و از طریق سانتریفیوژ در 900 گرم جمع می شوند. سلول ها در DMEM ( گلوکزِ پایین ) حاوی 10 درصد FBS که برای رشد سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی انتخاب شدند، کشت می شوند. آزمایشاتی که در این جا شرح داده شده از سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی که در قند خون ناشتا با 5/58 AFE بالا رشد می کنند، استفاده می شود.

حامل های آدنوویروس ها

آدنوویروس های نوترکیب که نقص ایمنی دفاعی دارند حامل ژن گزرشگر بتاگالاکتوسیداز هستند که تحت کنترل پیش برنده های فوری سیتومگالوویروس (CMV) یا پیش برنده های پایانه طولانی ویروس سارکوم Rous (CMV) هستند که از دانشگاه هسته ایِ حامل ژن ( دکترریچارد اندرسون) خریداری شده است. برای آزمایش حامل ها یاخته های بنیادی مزانشیمیِ انسانی با غلظت 10000 سلول پوشانده شد. غلظت افزایشی ویروس ها در محدوده ی بیش از 2000-100 عفونت، یک شب در سرم فاقد DMEM برای تعیین بهینه ی کارایی هدایتی، اعمال شد. روز بعد ویروسِ شناور بر سطح، حذف شد و سلول ها با تغییرات متعددِ DMEM ای که حاوی 10FBS درصد می باشد، شسته شد. دو روز لبعد، سلول ها با گلوتارآلدهید 0/2 درصد به مدت 2 دقیقه میکس شدند و رنگ آمیزی X-gal طبق دستورالعمل انجام شد. سلول های آلی بتاگالاکتوسیداز- مثبت در 10 زمینه ی میکروسکوپی (20×) شمارش شدند و به عنوان درصدی از تعداد کل سلول ها در این زمینه ها بیان شد.

پیوند سلولی

سلول های بدست آمده از 4 اهداکننده ی انسانی، برای آزمایشات پیوند سلولی مورد استفاده قرار گرفت. اولین یاخته های بنیادی مزانشیمی انسانیِ عبوری در چگالی پایین در DMEM با FBS 10 درصد پوشانده شدند. 2 الی 5 روز بعد، سلول ها با سرم فاقد DMEM شستشو شده و مشابه با AdRSlacz با MOI 1000 آلوده شدند. مایع رویی برداشته شد و سلول ها با DMEM با FBS 10 درصد شستشو داده شدند. این محیط کشت طی دو روز برای اطمینان از حذف ذرات ویروسی و اجازه برای درونی سازیِ هر گونه ذرات ویروسیِ باقیمانده روی سطح، چندین بار تغییر کرد. ( 5 روز ). در روز تشریح، سلول ها با EDTA-تریپسین 0/02 درصد برداشت شده و با PBS شسته شدند. سلول ها تا زمانی که کاشت و القا شوند معمولا طی 20 دقیقه روی یخ نگهداری می شوند.

سرکوب ایمنی موش نر بالغ ( که 4 تا 10 5فته سن دارد ) به عنوان گیرنده مورد استفاده قرار می گیرد.این سلول ها فاقد توانایی ایجاد پاسخ ایمنی انطباقی، واسطه ی سلولی T یا B و همچنین فقدان فعالیت سلولی کشنده ی طبیعی عملکردی می باشند. تمام روش های جراحی و حمل و نقل حیوان در توافق نامه ی مراقبت از حیوانات دانشگاه جانزهاپکینز و بررسی کمیته ی بهره برداری و دستورالعمل نهادی، بکار گرفته شد. متوکسی فلوران برای بیهوشی عمومی مورد ستفاده قرار می گیرد. حجم 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی حاوی 500000 یا یک میلیون سلول با یک سوزن به بطن چپ تزریق شد. هنگامیکه جریان برگشتی خون در سرنگ مشاهده شد، سوزن به میزان یک میلی متر دورتر پیشروی کرد و سوسپانسیون سلولی به آرامی تزریق شد. سپس برش دیواره ی شکم با بخیه ی ابریشمی بسته شد. کسری از سلول ها برای تزریقِ دوباره پوشانده شد و به طور هیستوشیمی به منظور تثبیت حالت ادامه یافته ی بتاگالاکتوسیداز در 1 روز و 1 تا 2 ماه رنگ آمیزی شد.

ایمونوهیستوشیمی

16 حیوان، برای پیوند سلولی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و با مصرف بیش از حد متوکسی فلوران در 30 دقیقه و 4 (n=3) ، 14 (n=3) ، 21 (n=2) ، 30 (n=4) و 60 (n=3) روز پس از جراحی کشته شدند. بافت شان شکافته شد و در ساکارزِ 30 درصد به مدت 4 ساعت نگهداری می شوند. بافت ها در TckocT –Tissue تعبیه شده، و 10 تا 16 میکرومتر قمت سرماسنج بدست آمد. طی برش دادن و تشریح قلب، سه بخش مجاور قطع شده و سرازیری های سرمازده به طور جداگانه قرار گرفتند. بخش میانی 3 ، برای رنگ آمیزی X-gal استفاده شد و بخش های مجاور در هر طرف برای ایمونوهیستوشیمی به عمل می آید. مقاطع بافتی برای رنگ آمیزی بتاگالاکتوسیداز ، با گلوتارآلدهید 0/2 درصد و فرمآلدهید 2 درصد به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق با استون یا استون/متانول استون/متانول 50 درصد تثبیت شده و سپس با PBS حاوی سرم بز حاوی سرم بز 5 درصدی انکوباسیون می شوند.

بخش های مشخص، به مدت 60 دقیقه با پادتن بتاگالاکتوسیداز پلی کلونال خرگوش در غلظت 10 گرم بر میلی لیتر در سرم یز 2 درصد در PBS و بدنبال آن FITC کنژوگه Ig G به مدت 45 دقیقه انکوباسیون می شود. پس از شستشوی کامل، آنتی بادی دوم برای 60 دقیقه ی اضافی اعمال شد که شامل یک پادتن مونوکلونال موش علیه دسمین، عضله ی مخطط، میوزین زنجیره سنگین، MyoD یا فسفولامبان می باشد. رنگ آمیزی تروپونین T قلبی با پادتن پلی کلونال بز انجام شد. در این مورد یک پادتنِ ( ضد بز ) TRITC کنژوگه شده برای شناسایی بتاگالاکتوسیداز بکار گرفته شد. تصویرسازی فلورسانس Zeiss Axiovert مجهز به میکروسکوپ کانفوکال Nikon PCM 200 انجام شد. در شرایط آزمایشگاهی تمایز میوژنی برای مقایسه، یاخته های بنیادی مزانشیمی انسانی که در ابتدا عبور می کنند برای آزمایشاتِ تمایزِ میوژنیِ اسکلتی با MyoD استفاده می شوند. سلول ها در محیط کشت پلاستی با تراکم بالا پوشانده می شوند و با MyoD روز بعد با آدنوویروس حاوی ژن MyoD انسان تحت کنترل پروموتر RSV آلوده می شوند. سلول ها در محیط کم سرم ( سرم 2 درصد اسب ) به مدت یک ماه نگهداری شده و به منظور ایمونوهیستوشیمی با همان آنتی بادی ها و همان روش گفته شده، فراوری می شوند.

نتایج

هدایت سلول بنیادی

آزمایشات اولیه ی برچسب گذاری نشان داد که یاخته های بنیادی مزانشیمی انسانی می توانند به طور کارآمد با استفاده از آدنوویروس های نوترکیب در MOL بالا، هدایت شود. پروموتر RSV نسبت به پروموتر CMV در بیان ژن lacZ در این سلول ها موثرتر است. برای AdRSVlaz ، حداکثر تعداد سلول های بیان کننده ی گالاکتوسیداز در MOI 1000 تا 1500 بدست آمد. این غلظت برای برچسب زنی سلول ها در آزمایشات کاشت استفاده شد. نمونه های hMSCs های هدایت یافته،که در محیط کشت نگهداری شدند نشان داد که تعداد سلول های بیان کننده ی بتاگالاکتوسیداز در یک ماه 90 درصد و در دو ماه 60 درصد بود.

پیوند آزمایشگاهی سلول های بنیادی

هدف از این آزمایشات ارزیابی توانایی hMSc ها برای پیوند و افتراق در قلب بزرگسالان است. برای این کار 5_10⁵ و 10_10⁵ یاخته های بنیادی مزانشیمی انسانی برچسب زده شده با AdRSVIacZ از طریق دیافراگم به داخل بطن چپ موشِ دارای نقص ایمنی تزریق شد. 4 روز بعد از تزریق، بیشتر سلول های بتا گالاکتوسیداز مثبت در طحال، کبد و ریه مشخص شدند. از 16 حیوان، در 4 حیوان هیچ hMSc ای در قلب شناسایی نشد که احتمالا بخاطر مشکلات فنی مرتبط با تزریق در قلبِ در حالِ تپش بود. در 12 حیوان، hMSc ها در سراسر عضله قلب به صورت سلول های فردی در 4 تا 60 روز پراکنده شدند. مقدار hMSc های بتا گالاکتوسیداز مثبت از بخش های سر به طور تخمینی نشان داد که از 500000 سلول hMSc 2200 در بطن چپ تا مدت 4 روز پس از جراحی زنده می مانند. hMSc های کمتری در قلب در نقاط زمانیِ بعد شناسایی شد. اما_در هر قسمت بافت تقریبا یک عدد سلول بتا گالاکتوسیداز مثبت یافت شد.

با گذشت زمان بیشتر سلول های بتا گالاکتوسیداز مثبت به طور مورفولوژی از اطراف قلب ( کاردیومیوسیت ) غیر قابل تشخیص می شوند. برچسب زنی آنتی-بتاگالاکتوسیداز (فلورئسین سبز ) و تروپونین T قلبی ( رودامین قرمز ) در 14 روز انجام می شود. سلول های بتا گالاکتوسیداز مثبت نیز برای آلفا اکتنین مثبت بودند. یک جزء از گروه های Z در 60 روز نشان داده شده است. به طور مشابه سلولِ پیوند یافته برای MHC مثبت بودند. hMSc های پیوند یافته برای بیان فسفولامبین یافت می شوند که فسفوپروتئینی ست که نقشی کلیدی در تعدیل شبکه ی سارکوپلاسمی قلبی ATP-Ca₂O- آز دارد. تصویرسازی با بزرگ نمایی بالا از این سلول ها، سازماندهی سارکومری آلفا اکتنین، تروپونین T قلبی و دسمین را نشان داد. هیچ یک از سلول های بنیادی مزانشیمی انسانیِ مشخص شده در بخش های قلب، با پادتن MyoD واکنش ندارند. برای تشخیص بیشترین تمایز میوژنی قلبی و اسکلتی hMSc های کاشت شده در قلب، به تجزیه تحلیل و آنالیز بیان این نشانگرها به نشانگرهای بیان شده در میولوله ها که توسط hMSc های هدایتگر MyoD در شرایط آزمایشگاهی شکل گرفت، پرداختیم. hMSc های هدایت شده MyoD سطوح بالایی از MyoD نو هسته را پس از آلودگی با AdRSV MyoD نشان دادند. بعد از انتقال MyoD ، hMSc های مجاوز ذوب شده و میولوله های چند هسته ای را تشکیل می دهند. در یک ماه، سلول های تمایز یافته، دسمین، آلفا اکتنین و بتا MHC را بیان می کنند اما هیچ سطح غیر قابل تشخیصی از فسفولامبان یا تروپونین قلبی T مشاهده نشد. مجددا سازماندهی سارکومری پروتئین های انقباضی با بزرگنمایی بالا نشان دهنده ی تمایز میولوله ی بالغ بود.

بحث

روش جداسازیِ hMSc ها از مغز استخوان بزرگسال که در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفته است موجب ایجاد یک جمعیت سلولی همگن شده که قادر به تمایز چندین اجداد مزانشیمی می باشد. در 4 روز اظهار شد که هیچ یک از سلول های بتاگالاکتوسیداز مثبت دسمین را بیان نکردند، hMSc ها به سرعت در محل تزریق سوزنِ سرنگ یافت شدند اما در زمان های بعدی hMSc های بازمانده بیشتر به صورت تکی پراکنده شدند. این سلول های مقاوم، دور از محل سوزن سورنگ یافت شد و به احتمال زیاد از طریق عبور از اندوتلیوم وارد میوکارد می شوند، اگرچه شواهد مستقیمی در این باره موجود نیست. این فرایند ممکن است شبیه به راندن لوکوسیت ها به اندوتلیوم بوده و شامل اینتگرین و سایر ملکول های چسبنده ی موجود در سطح hMSc ها می باشد. به علاوه اتصال مویرگی ممکن است نقش مهمی در افزایش نفوذپذیری اندوتلیال داشته باشد. مهاجرت ترانس اندوتلیال از مویرگ های عروق کرونر و ادغام سلول ها به عضله ی قلب موش قبلا با میوبلاست ها و سلول های مشتق شده از مغز استخوان مشاهده شده است. به طور شفاف درک بیشتر این مکانیسم ها از مهاجرت و تمرکز سلولی ممکن است ارائه ی موثرتر میوکارد hMSc ها میسر سازد.

دسمین به عنوان نشانگر اولیه برای تمایز میوژنی سنتز شده توسط سلول های پیش ساز عضلانی، شناخته می شود. در این آزمایش ها هیچ یک از hMSc های پیوند شده دسمین را در 4 روز بیان نکردند در حالیکه در 60 روز تمام سلول های بتاگالاکتوسیداز مثبتِ قابل تشخیص، بیان می کنند.

hMSc ها همچنین تروپونین T قلبی ، بتا-MHC ، آلفا اکتنین و فسفولامبین و گره های سارکومری در بزرگنمایی بالا مشهود بودند. به میزان قابل توجهی شدت ایمونوهیستوشیمی برای این پروتئین ها در hMSc های پیوندی از اطراف قلب غیر قابل تشخیص است.

بیان نشانگرهای میوژنی در سلول های پیوند یافته با بیان موجود در میولوله های بدست آمده توسط hMSc های بیان کننده ی MyoD در شرایط آزمایشگاهی مقایسه شد. نشان داده شد که بیان اجباری MyoD در سلول های بنیادی مزودرمی باعث شکل گیری میولوله از هر دو نوع انقباض کند و تند شده و از آن هایی که توسط میوبلاست های اولیه تشکیل شده اند ، غیر قابل تشخیص است. hMSc های انتقال دهنده ی MyoD ، دسمین، آلفا اکتنین و بتا – MHC را بیان می کند اما هیچ فسفولامبان یا تروپونین قلبی ای تشخیص داده نشد، دو پروتئین سازنده عمدتا به عضله ی قلبی محدود می شوند. این اطلاعات همراه با هم دلالت بر تبدیل hMSC های پیوند یافته به عضله ی قلبی به جای عضله ی اسکلتیِ کند انقباض دارد. با این که از لحاظ نظری امکان تبدیل hMSC ها به فنوتیپ عضله ی اسکلتی و سپس انطباق با محیط قلبی همانطور که برای سلول های C₂C₁₂ پیشنهاد شد وجود دارد، اما با توجه به داده ها و اطلاعات داده شده این امکان بعید یافت شد.

سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و همچنین کاردیوسیت ها ( قلب ) از مزودرم اولیه مشتق شده اند. گرچه از مناطق مختلف جنینی شکل گرفته اند. سلول های پیش ساز کاردیومایوسیت از یک بخش واقع در مزودرم تشکیل شده که تحت تاثیر عوامل تمایزِ مترشحه از اندودرم مجاور سرنوشتشان تغییر می کند. قلب بزرگسالان به طور فعال فاکتور رشد شبه انسولین را ترشح می کند ، فاکتور رشد بتا (TGF)- را تبدیل کرده و فاکتور رشد اپیدرمیِ اتصال هپارین که به عنوان محرک رشد اتوکرین برای قلب عمل می کند. TGF برای القاء تمایز قلبی در خط سلولی مزودرمی جنینی مرغ نشان داده شد و بتا – TGF علامت دهنده ی اکتیوینِ ملکولی در پیدایش قلب دوزیستان و پرندگان مشارکت دارد. تولید نوروگلین ها موجب ترویج بقا و رشد میوسیت قلبی توسط گیرنده های ErbBZ و B4 که باعث اتصال فاکتورهای شبه رشد اپیدرمی هپارین می شود. در مطالعه ی حاضر فرایند تمایز در داخل بدن مشاهده شد که به احتمال زیاد شامل ترکیبی از سیگنال های رشد پاراکرین و محرک های الکتریکی و مکانیکیِ موجود در قلب بزرگسالان می باشد.

گزارشات اخیر از قابلیت سلول های مغز برای مهاجرت از مغز استخوان و یکپارچه سازی و تمایز به ماهیچه های اسکلتیِ آسیب دیده و ماهیچه ی قلبی نشان داد که این فرایندها به طور معمول به ترمیم و نگهداری بافت یا بازسازی کمک می کنند گرچه این فرآیندها ممکن است کارامد نباشند. سایر گزارش های اخیر پتانسیل موش یا سلول های مغز موش را برای پیوند یا جاسازی در میوکارد قلب نشان داد و حمایت های بیشتری در رابطه با این امکان ارائه داد.

مطالعات حاضر قابلیت های hMSC های بزرگسال را در رابطه با ادغام و تحت تمایز عضله ی مخطط قرار گرفتن در قلب بزرگسالان و امکان استفاده از این سلول های بنیادی بالغ انسان را برای کاردیومیوپلاستیِ درمانی فراهم کرد.

جهت دانلود محصول اینجا کلیک نمایید